突如其來的19新(xīn)型冠狀病毒給國(guó)人的新(xīn)年蒙上了一層陰影，一時間，醫(yī)生搶上陣，民(mín)衆搶隔離，今天筆(bǐ)者也搶一微文(wén)，和大家聊聊冠狀病毒檢測技(jì )術。
針對冠狀病毒的檢測方法主要包括檢測病毒相關蛋白或患者體(tǐ)内中(zhōng)和抗體(tǐ)的抗原-抗體(tǐ)法（主要為(wèi)酶聯免疫法）、檢測病毒核酸的PCR法、病毒分(fēn)離鑒定、芯片法等等，前兩者在臨床上具(jù)有(yǒu)較強的可(kě)操作(zuò)性，應用(yòng)也最廣泛。酶聯免疫法和PCR法均具(jù)有(yǒu)較高的檢測準确率，二者配合使用(yòng)則可(kě)獲得更客觀的臨床診斷數據。但由于酶聯免疫法試劑盒的研制需要病毒相關蛋白的體(tǐ)外表達、純化及相應抗體(tǐ)的制備，研制周期相對較長(cháng)。而核酸檢測試劑盒的研制則更為(wèi)快捷，隻要知曉了病毒基因組序列，便可(kě)設計出相應的擴增引物(wù)，再與常規的PCR檢測試劑包裝(zhuāng)成試劑盒便易如反掌。
猶記03年時，媒體(tǐ)還沒有(yǒu)如此發達，每天隻能(néng)在電(diàn)視新(xīn)聞中(zhōng)聽聞今天又(yòu)新(xīn)增了幾例病例；技(jì )術也沒有(yǒu)如此先進，臨床診斷還主要是采用(yòng)血常規結合X射線(xiàn)胸片的方法，誤診率較高。全球首個SARS病毒血清抗原檢測試劑盒直至2003年的12月，也就是抗擊非典結束後半年才姗姗來遲。筆(bǐ)者在國(guó)家藥品監督管理(lǐ)局網站上查詢到，從2003年到2018年15年間，僅有(yǒu)8款針對冠狀病毒的檢測試劑盒獲批（表1），其中(zhōng)7款為(wèi)國(guó)産(chǎn)酶聯免疫試劑盒，1款PCR-熒光探針法核酸檢測試劑盒。其中(zhōng)華大吉比愛生物(wù)技(jì )術有(yǒu)限公(gōng)司的4款試劑盒檢測對象是患者體(tǐ)内産(chǎn)生的SARS特異性IgM或IgG抗體(tǐ)，珠海經濟特區(qū)海泰生物(wù)制藥有(yǒu)限公(gōng)司的2款試劑盒則是針對SARS病毒的N-蛋白進行檢測。值得注意的是，針對當年SARS-coV檢測的最早的一款試劑盒也是疫情過去4個月後才獲批成功。
表1 2003-2018年獲批冠狀病毒檢測試劑盒
（數據來源：國(guó)家藥品監督管理(lǐ)局網站）
時光流轉到2019年，當冠狀病毒披着“新(xīn)型铠甲”卷土重來時，短短1個月餘的時間内國(guó)家藥監局已審批通過了7款試劑盒（表2）。而已研制成功的試劑盒更是多(duō)達17種，涉及21家企業。體(tǐ)外診斷（IVD）公(gōng)司的迅速反應，體(tǐ)現了我國(guó)在疾病檢測領域的飛速發展。不僅如此，相關企業也在加足馬力對2019-coV的相關蛋白進行體(tǐ)外表達純化并積極推進着相關抗體(tǐ)的制備，預示着酶聯免疫試劑盒也即将問世。
表2 2020年獲批冠狀病毒檢測試劑盒
（數據來源：國(guó)家藥品監督管理(lǐ)局網站）
相對于藥物(wù)和疫苗，病毒檢測技(jì )術普适性更強，看似更容易被攻克，但在具(jù)體(tǐ)應用(yòng)層面，仍面臨着許多(duō)個性的問題，如不同病毒的樣本獲取及核酸提取的差異、以及檢測結果的偏差等。對于冠狀病毒檢測技(jì )術的研發現狀如何，迅速推出的試劑盒是否意味着我們可(kě)以從容應對一切突發病毒的檢測，以下将從專利大數據的角度，對我國(guó)及全球冠狀病毒檢測技(jì )術發展狀況進行解讀，以期為(wèi)應對突發性疫情提供一些思路。
冠狀病毒檢測技(jì )術的研發屬于“事件主導型”研發
由圖1可(kě)以看出，2003年“非典”疫情到來之前，學(xué)術屆對于冠狀病毒的檢測并不十分(fēn)關注，無論是蛋白檢測，還是核酸檢測，年均專利申請量在10件左右。而2013年SARS疫情席卷中(zhōng)國(guó)，冠狀病毒專利申請也出現了爆發式增長(cháng)，達到了近200件。而當疫情過後，專利申請量又(yòu)呈現斷崖式下跌。直至2015年，中(zhōng)東呼吸綜合征（MERS）在韓國(guó)爆發，專利申請也相應出現反彈，但由于有(yǒu)了上一次疫情中(zhōng)的技(jì )術積累，專利申請量也沒有(yǒu)增長(cháng)太多(duō)。MERS疫情過後，相關專利申請量保持平穩狀态。由于專利申請公(gōng)開滞後，2018年後的專利申請量還不能(néng)反映實際數量，由于此次中(zhōng)國(guó)“新(xīn)冠”疫情，預計2019-2020年的專利申請量還會出現一波增長(cháng)。
在檢測對象方面，從下圖也可(kě)以注意到，2015年MERS疫情爆發之前，學(xué)界更多(duō)關注的是蛋白檢測。而MERS疫情是個分(fēn)水嶺，之後核酸檢測便占據了主導地位。本次“新(xīn)冠”事件中(zhōng)，中(zhōng)國(guó)藥監局審批通過的7個試劑盒也清一色均為(wèi)核酸檢測試劑盒。
冠狀病毒檢測技(jì )術屬于小(xiǎo)衆研發領域
2003年前，冠狀病毒檢測的研究由美國(guó)、日本及歐洲的一些國(guó)家主導，主要為(wèi)基礎性研究，中(zhōng)國(guó)并未過多(duō)的參與其中(zhōng)，各國(guó)的申請量也很(hěn)少。而2003年由于中(zhōng)國(guó)“非典”爆發，中(zhōng)國(guó)在冠狀病毒檢測方面的專利申請一躍成為(wèi)全球第二，申請量占據全球的32%，僅次于美國(guó)，這對知識産(chǎn)權保護尚處于起步階段的中(zhōng)國(guó)來講實屬不易，顯示了中(zhōng)國(guó)學(xué)術界用(yòng)科(kē)學(xué)打敗疫情的決心。與此同時，受“非典”影響，亞洲的中(zhōng)國(guó)台灣、新(xīn)加坡、中(zhōng)國(guó)香港等地區(qū)的專利申請量也跻身全球前列。“非典”過後，美國(guó)繼續領跑，但各國(guó)的申請量都出現了斷崖式下跌。雖然2004-2014這十年是分(fēn)子生物(wù)學(xué)飛速發展的一段時期，新(xīn)技(jì )術不斷湧現，而美國(guó)也是絕大多(duō)數核心技(jì )術的發源地，如二代測序、抗體(tǐ)技(jì )術、基因編輯技(jì )術等，但對于冠狀病毒檢測的研發，并沒有(yǒu)再出現過大幅的增長(cháng)。2015年後，随着各類平台技(jì )術的不斷成熟，新(xīn)技(jì )術的開發進入平台期，而随着中(zhōng)國(guó)知識産(chǎn)權制度的不斷完善，研發主體(tǐ)專利保護意識的不斷增強，中(zhōng)國(guó)在各領域的專利申請量大幅增長(cháng)，冠狀病毒檢測領域申請量也超越美國(guó)躍居全球首位。
放眼全球，美國(guó)長(cháng)期處于研發領先地位。而由于前兩次冠狀病毒疫情均發生在亞洲，在2003年及之後後韓國(guó)和日本在病毒檢測領域的專利申請量也在大幅增長(cháng)，處于全球前五的位置。從絕對申請量來看，申請量最高的2003年，最多(duō)的美國(guó)也隻有(yǒu)85件專利申請，相對于動辄年申請量上千件的腫瘤檢測領域，實在是鳳毛麟角。可(kě)見，冠狀病毒檢測技(jì )術一直以來就屬于小(xiǎo)衆研發領域。
美國(guó)在冠狀病毒檢測研發領域起步于上世紀80年代，起步較早，且由于掌握衆多(duō)核心平台技(jì )術，在該領域的專利申請量長(cháng)期領跑全球，直至2015年被中(zhōng)國(guó)超越。中(zhōng)國(guó)比美國(guó)起步晚了近20年，但由于“非典”事件，能(néng)夠在2年内躍居全球申請量第二，并在此後十餘年間一直保持了這個地位。日本同樣起步較早，且一直以來申請量保持平穩。韓國(guó)和中(zhōng)國(guó)起步時間相同，各年度的申請量與日本相差不多(duō)，在10件上下。
研發主體(tǐ)見招拆招，昙花(huā)一現
2003年前，冠狀病毒的研究由美國(guó)主導，全球排名(míng)前五位的申請人也基本被美國(guó)申請主體(tǐ)占據。2003年，申請量前7位的申請人則均屬于亞洲，其中(zhōng)中(zhōng)國(guó)占據5席，中(zhōng)國(guó)香港和新(xīn)加坡各占1席。2004-2014年，中(zhōng)、美、韓三國(guó)的申請主體(tǐ)排名(míng)全球前列。2015年後，中(zhōng)國(guó)不僅在總申請量上躍居全球首位，在申請人排名(míng)上全球前7位中(zhōng)有(yǒu)6位中(zhōng)國(guó)申請人，而這份排名(míng)中(zhōng)也出現了基因編輯技(jì )術核心專利持有(yǒu)者——布羅德(dé)研究所有(yǒu)限公(gōng)司的身影，預示着新(xīn)的病毒檢測技(jì )術橫空出世。
縱觀全球各個時期，并沒有(yǒu)任何申請人能(néng)夠長(cháng)期穩居前列，且每個時期排名(míng)靠前的申請人的專利申請數量也均是個位數，冠狀病毒檢測領域呈現百花(huā)齊放、“你方唱罷我登場”的态勢。這也顯示了冠狀病毒作(zuò)為(wèi)短時集中(zhōng)爆發式出現的病毒，并未引起任何一個研發主體(tǐ)對其檢測方法進行持續性的投入研究，更多(duō)的是見招拆招式的應對式研究。
借力平台技(jì )術的發展穩步推陳出新(xīn)
（1）2003年前——積铢累寸
早期的冠狀病毒檢測均是采用(yòng)動物(wù)病毒進行的研究性開發。早在1983年，日本KACHIKU EISEI SHIKENJO JAPAN的專利申請JP1984218959A首次報道了牛冠狀病毒的抗體(tǐ)檢測方法。
2001-2002年，來自英國(guó)皇家獸醫(yī)學(xué)院及美國(guó)輝瑞公(gōng)司的科(kē)學(xué)家在體(tǐ)外表達了犬冠狀病毒（WO2004011651A1）和貓冠狀病毒的S蛋白（US20020115064A1），并提出了基于酶聯免疫法檢測犬冠狀病毒和貓冠狀病毒的方法。
也是在2001年，美國(guó)密歇根州立大學(xué)的專利申請US20050239057A1較早地報道了采用(yòng)多(duō)重RT-PCR / PCR方法檢測牛冠狀病毒的方法，自此開啓了冠狀病毒核酸檢測的大門。
（2）2003年——一觸即發
2003年，“非典”在中(zhōng)國(guó)爆發，這一年的專利申請達到了179項，其中(zhōng)核酸檢測89項，蛋白檢測104項，檢測技(jì )術方面也呈現多(duō)樣化，多(duō)種分(fēn)子生物(wù)學(xué)前沿技(jì )術被提出應用(yòng)于冠狀病毒的檢測。
美國(guó)偉勝科(kē)技(jì )有(yǒu)限公(gōng)司的專利US7629114首次提出通過将生理(lǐ)溶液引入結膜囊并收集排入口咽的灌溉來收集鼻咽标本的方法以收集鼻咽細胞和分(fēn)泌物(wù)以診斷病毒性上呼吸道感染，大大提高了獲取檢測樣本的便利性。
美國(guó)聯合生物(wù)醫(yī)學(xué)公(gōng)司的專利申請US20050100883A1報道了采用(yòng)SARS冠狀病毒（SCoV）的膜糖蛋白（M），刺突糖蛋白（S）和核衣殼蛋白（N）作(zuò)為(wèi)包被抗原檢測SARS相關抗體(tǐ)的酶聯免疫測定（ELISA）方法。
日本榮研化學(xué)株式會社的專利申請WO2005001097A1提出了嚴重急性呼吸綜合征(SARS)病毒高靈敏度且快速的檢測方法，其根據SARS冠狀病毒RNA聚合酶堿基序列設計引物(wù)，通過核酸擴增法對病毒進行檢測。
美國(guó)基因耐克生物(wù)醫(yī)學(xué)制品有(yǒu)限公(gōng)司的專利申請WO2005038039A2公(gōng)開了可(kě)以進行多(duō)重擴增反應的TempPCR方法，可(kě)實現對靶序列的敏感和特異性擴增。
香港YEUNG WAH HIN ALEX的專利申請US20040229211A1公(gōng)開了使用(yòng)一種染料（MOD）的多(duō)重實時PCR的敏感診斷測試方法及其在嚴重急性呼吸綜合征（SARS）的應用(yòng)。
廣州萬孚生物(wù)技(jì )術股份有(yǒu)限公(gōng)司的專利申請CN1453589A公(gōng)開了基于抗原抗體(tǐ)反應的膠體(tǐ)金層析法檢測SARS冠狀病毒抗原的試劑盒。
王虹的專利申請CN1455003A公(gōng)開了分(fēn)子信标法檢測SARS冠狀病毒，适用(yòng)于定性、定量檢測呼吸道分(fēn)泌物(wù)、血清、病檢組織和各種排洩物(wù)等标本中(zhōng)的SARS－Cov RNA。
（3）2004-2014年——風平浪靜
從“非典”事件結束到MERS疫情到來前的2004-2014年間，分(fēn)子生物(wù)學(xué)飛速發展，随着抗體(tǐ)制備技(jì )術的不斷推陳出新(xīn)以及二代測序時代的到來，冠狀病毒檢測技(jì )術也随着平台技(jì )術的發展而不斷更新(xīn)，但由于這個時期并無市場需求，專利申請多(duō)為(wèi)探索性研究，集中(zhōng)于表位蛋白的分(fēn)離表達以及對于病毒的高通量檢測的嘗試，涉及核酸檢測193項，蛋白檢測249項。
表位蛋白的成果分(fēn)離表達即可(kě)用(yòng)于病毒檢測，又(yòu)可(kě)用(yòng)于疫苗制備。中(zhōng)國(guó)科(kē)學(xué)院上海生命科(kē)學(xué)研究院的專利申請CN101085812A公(gōng)開了一種SARS冠狀病毒多(duō)肽抗原，在臨床診斷中(zhōng)具(jù)有(yǒu)應用(yòng)價值。中(zhōng)國(guó)科(kē)學(xué)院武漢病毒研究所的專利申請CN101100680A公(gōng)開了高效表達SARS冠狀病毒S蛋白的重組杆狀病毒CCTCC NO：V200703，在疾病診斷及疫苗生産(chǎn)等相關領域的重要應用(yòng)價值。美國(guó)人力資源與健康服務(wù)部的專利申請WO2005010034A1公(gōng)開了來自病毒（SARS-CoV）的刺突蛋白，可(kě)用(yòng)于治療和診斷。财團法人國(guó)家衛生研究院的專利申請 WO2005103259A1公(gōng)開了SARS-cov核衣殼蛋白表位。
二代測序技(jì )術的出現使高通量核酸檢測成為(wèi)可(kě)能(néng)，大大提高了核酸檢測的便利性。國(guó)家質(zhì)量檢驗檢疫總局動植物(wù)檢疫實驗所的專利申請CN103205509A公(gōng)開了采用(yòng)懸浮芯片技(jì )術的13種呼吸道病毒高通量檢測方法，可(kě)對包括冠狀病毒SARS-CoV在内的13中(zhōng)呼吸道病毒進行高靈敏度、高通量的檢測。韓國(guó)基因特力株式會社的專利KR100625325B1公(gōng)開了用(yòng)于檢測SARS病毒的N蛋白的引物(wù)和探針組合物(wù)。中(zhōng)山(shān)大學(xué)的專利申請CN102732638A公(gōng)開了人冠狀病毒OC43、229E、NL63、HKU1和SARS一管多(duō)重熒光PCR檢測方法及其引物(wù)、探針和試劑盒，可(kě)實現對人冠狀病毒五種型别的一管多(duō)重檢測。
（4）2015年後——橫空出世
2015年，MERS疫情在韓國(guó)爆發。有(yǒu)了前期的技(jì )術積累，核酸檢測試劑盒得以迅速研制并應用(yòng)于臨床檢測，在病人的診斷方面可(kě)以說比“非典”時期有(yǒu)了很(hěn)大的進步。由于冠狀病毒檢測技(jì )術的成熟，雖然疫情再次來襲，專利申請量也沒有(yǒu)出現大幅增長(cháng)的情況。值得注意的是，2015年冠狀病毒檢測的專利申請人名(míng)單中(zhōng)，“布羅德(dé)研究所”的名(míng)字赫然在列。布羅德(dé)研究所的張鋒研究員是真核細胞基因編輯技(jì )術的創始人，推動了基因編輯技(jì )術在2012年後飛速發展。布羅德(dé)研究所的專利申請WO2017040316A1的提出也正式宣告基因編輯技(jì )術登上了冠狀病毒檢測的舞台。
結語
由以上分(fēn)析可(kě)知，各國(guó)研發主體(tǐ)對于冠狀病毒檢測技(jì )術并未投入很(hěn)大的研發精(jīng)力，技(jì )術發展更多(duō)借力于平台技(jì )術的發展及與相關RNA病毒的檢測技(jì )術的相互借鑒而穩步推進。雖然本次“2019-coV”疫情中(zhōng)我們應對迅速，核酸檢測試劑盒快馬加鞭的被研制、審批、生産(chǎn)，但這些“趕制”出的試劑盒在實際應用(yòng)中(zhōng)也是反響不一，通常需要幾個試劑盒同時檢測才能(néng)獲得比較準确的結果，造成了一定程度上的資源浪費。
對于冠狀病毒這類偶發性病毒，若長(cháng)期大量投入研發，勢必造成資源浪費，同時由于其自身危害性極大，研發活動也會受諸多(duō)限制，大面積鋪開研發是不現實的。但雖然其他(tā)RNA病毒的檢測方法具(jù)有(yǒu)可(kě)借鑒性，但畢竟也存在着冠狀病毒檢測中(zhōng)個性的問題，如由于樣本的獲取、運輸、保存、引物(wù)特異性、檢測方法本身、試劑盒質(zhì)量控制等諸多(duō)因素造成的假陰、假陽性問題，又(yòu)無法在短時間克服。因此，在未來的研發道路上，可(kě)采取合理(lǐ)分(fēn)配研發資源，加強國(guó)際合作(zuò)，必要時也可(kě)充分(fēn)動員民(mín)間力量，如成立病毒研究基金會等措施，對冠狀病毒核酸檢測中(zhōng)檢測樣本的獲取及質(zhì)量控制、引物(wù)特異性、檢測标準的完善、試劑盒質(zhì)量控制，以及抗原-抗體(tǐ)檢測方法中(zhōng)涉及的病毒蛋白的體(tǐ)外表達、抗體(tǐ)的制備等具(jù)體(tǐ)領域進行有(yǒu)針對性的研究，為(wèi)從容應對突發疫情做足技(jì )術儲備。
